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20%甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维优博国际娱乐平台

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优博娱乐平台登陆,败血冲心证

  本发明属于生物技术领域,尤其是涉及一种新的编码美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamsela)外膜蛋白V(outer membrane protein V,OmpV)的多核苷酸,以及此多核苷酸编码的多肽,还涉及该多核苷酸和多肽的制备方法及其用途。

  杆菌是目前研究最多的一种革兰氏阴性细菌优博平台革兰氏阴性细菌因其独特的细胞壁结构,具有很强的适应性和抗逆性。革兰氏阴性细菌大多数为条件致病菌,当机体免疫力低下时可引起多种感染,人类和牲畜中有很多疾病是由革兰氏阴性细菌引起的。主要致病性杆菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌等,它们产生内毒素,通过内毒素使人致病。1996年在日本发生了一次世界上最大的由O157:H7大肠杆菌引起的爆发流行。大肠杆菌(Escherichia coli)在自然界分布很广,是人和动物肠道中的正常菌群。正常情况下一般不致病,但它是条件致病菌。近年来,世界范围的细菌感染类型和感染细菌有着明显变化,原来对人类生命威胁最大的病菌正逐渐被非致病的弱毒菌和条件致病菌所取代。美人鱼发光杆菌就是目前比较重视的这一类细菌。美人鱼发光杆菌是一种革兰氏阴性,可以发光的,兼性厌氧杆菌,它最初是1981年,从在温暖海水中生长的鲱鱼的溃疡伤口中分离到的,并分类到弧菌属,称为美人鱼弧菌,因为它能引起的人畜病证与弧菌属相似,均能引起人类肠胃炎、伤口感染和人畜败血病(CURRENT MICROBIOLOGY Vol.48(2004),pp.167-174 Cloning and Characterization of the Gene Encoding for OMP-PDPorin:The Major Photobacterium damsela Outer Membrane Protein)。在1991年基于16sRNA基因序列的比较和染色体DNA-DNA杂交数据将其归类到杆菌属,称为美人鱼发光杆菌(Shin JH,Shin MG,Suh SP,Ryang DW,Rew JS,Nolte FS.Primary Vibrio damselasepticemia.Clin Infect Dis 1996;22:856-857.)。它是一种具极端破坏性的引起组织坏死传染病的细菌,它不仅会引起假结核病和鱼出血性败血症,导致渔产养殖损失50%以上;还能通过人的伤口或者是食用未熟海产品而使人致病,在日本就发生过多起渔民感染了美人鱼发光杆菌而严重致病的事件。更可怕的是,越来越多的报道表明美人鱼发光杆菌具有强致死性,能同时以有免疫缺陷或者是健康人为宿主,并诱发快速的,爆发性的传染(Fraser SL优博平台Purcell BK,Delgado B Jr,Baker AE,Whelen AC.Rapidly fatal infectiondue to Photobacterium(Vibrio)damsela.Clin Infect Dis 1997;25:935-936.)。

  OmpV是细菌外膜蛋白中的一个重要蛋白,目前对OmpV蛋白的研究是非常少的。在所有细菌中,仅获得Salmonella enterica、霍乱弧菌和副溶血弧菌等3种细菌的基因序列。对于其结构和功能,仅仅只是认为OmpV可能是一个孔蛋白,是一个可以热诱导的,具高免疫原性的蛋白所以OmpV是一个非常值得关注和深入研究的蛋白。

  尚未见有任何公开或报道过提及的美人鱼发光杆菌OmpV核苷酸序列。也未见有报道过杆菌OmpV蛋白具有盐敏感功能。

  本发明的另一目的是提供一种编码具有美人鱼发光杆菌外膜蛋白V蛋白质活性的多肽的核苷酸序列。

  本发明的第三目的是提供一种利用重组技术制备上述新的美人鱼发光杆菌外膜蛋白V的方法。

  本发明还提供了这种美人鱼发光杆菌外膜蛋白V和编码序列的应用,即提供了该蛋白的一种新的功能,即盐敏感功能,在提高生物细胞盐敏感性的应用。

  本发明所说的美人鱼发光杆菌外膜蛋白V,其特征在于:该多肽含有SEQ ID NO.4的氨基酸序列。

  本发明所说的分离的多核苷酸,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列选自下组:(a)编码含有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸;(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

  所说的“分离的”、“纯化的”DNA是指,该DNA或片段已从天然状态下从位于其两侧的序列中分离出来,还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随的核酸的组份分开,而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

  在本发明中所说的载体可选用本领域已知的各种载体,如市售的载体,包括质粒,粘粒等。在生产本发明的美人鱼发光杆菌OmpV多肽时,可以将美人鱼发光杆菌OmpV编码序列可操作地连于表达调控序列,从而形成美人鱼发光杆菌OmpV蛋白表达载体。

  所说的“可操作地连于”指这样一种状况,即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如,如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌,那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录,那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时,那么它是可操作地连于编码序列。一般,“可操作地连于”意味着相邻,而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

  所说的“宿主细胞”为原核细胞。常用的原核宿主细胞为大肠杆菌i)或枯草芽孢杆菌等,优选E.coli DH5α;E.coli BL21和E.coli TOP10等。

  还可以用美人鱼发光杆菌OmpV特异抗体的Western印迹分析来分析美人鱼发光杆菌OmpV基因产物的表达,并证实其在生物样本中的表达。

  此外,根据本发明的美人鱼发光杆菌OmpV核苷酸序列和氨基酸序列,可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上,筛选美人鱼发光杆菌OmpV同源基因或同源蛋白。

  另外,根据本发明的美人鱼发光杆菌OmpV蛋白的盐敏感功能及分子量,可以在不同盐度下筛选美人鱼发光杆菌OmpV同源基因或同源蛋白。

  本发明的美人鱼发光杆菌OmpV核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或文库筛选法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物,并用美人鱼发光杆菌做为模板,扩增而得有关序列。

  一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

  此外,还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前,现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段,然后再进行连接而获得编码本发明美人鱼发光杆菌OmpV蛋白的核酸序列。然后,可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

  图1为不同盐度条件下美人鱼发光杆菌外膜蛋白SDS-PAGE图谱比较。在图1中,1-4分别表示盐度为0.5%,1%,4%,M表示mark,KDa表示分子量的大小。

  图2为在不同盐度条件(0.5%,1%,4%)下,美人鱼发光杆菌外膜蛋白双向电泳图谱比较。

  图3为PET-OmpV克隆子在E.coli BL21中的诱导表达。在图3中,2、3为所克隆的基因的表达条带;1为空载体的条带。

  图4为PLLP-OmpA-OmpW克隆子的PCR鉴定。在图4中,1为阴性对照,2为阳性对照,3~10为阳性克隆的PCR鉴定,单位为Kb。

  下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。

  实施例1美人鱼发光杆菌OmpV基因的克隆1.细菌的获得与培养从海域中获取的各种细菌,经简单的分离纯化后,用弧菌专用培养基TCBS初步筛选获得一呈绿色菌落,经厦门市疾控中心VITEK32型全自动细菌鉴定仪鉴定后定为美人鱼发光杆菌。

  挑取美人鱼发光杆菌单菌落于LB培养基培养过夜后,加30%甘油-70℃保存。

  2.基因的全长克隆(Cloning of full-length DNA)由于美人鱼发光杆菌基因的全序列还未测定,目前也无该菌OmpV的基因序列报道。鉴于副溶血弧菌已完成全序列测定,我们按其的OmpV序列设计了OmpV基因引物,用于美人鱼发光杆菌OmpV的PCR扩增。由此,可根据副溶血弧菌OmpV序列的5`端和3`端并加上酶切位点和两个保护碱基设计引物,R1:5’-GGGGATCCATGAACAAGACACT-3’(记为SEQ ID NO.1)为正向引物,寡核苷酸R2:5’-CCGCTAGCTTAGAAGTTGTAAGACAC-3’(记为SEQ ID NO.2)为反向引物,以美人鱼发光杆菌为模板,对美人鱼发光杆菌OmpV蛋白进行PCR扩增,R1/R2的PCR条件为94℃5分钟,随之以94℃1分钟、55℃1分钟和72℃90秒进行35个循环,最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物,获得扩增片段长度为777bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序,获得SEQ ID NO.3所示的序列。

  实施例3  美人鱼发光杆菌OmpV蛋白的结构和功能研究以下给出不同盐浓度条件下美人鱼发光杆菌OmpV的变化:在提取了美人鱼发光杆菌在0.5%、1%及4%这三种盐浓度培养条件下的外膜蛋白以后,首先通过SDS-PAGE对它们外膜蛋白图谱进行比较分析,结果如图1所示。从图1中可以清楚地看到,随着盐度的逐渐上升,有一个蛋白条带也相应表现出在量上的逐渐下渐,这表明这条蛋白条带与美人鱼发光杆菌的盐适应性具有紧密相关性。结合对美人鱼发光杆菌外膜蛋白的鉴定结果可以知道,这个条带为OmpV。

  美人鱼发光杆菌OmpV蛋白的克隆及诱导表达后对菌体盐敏感性的影响:按实施例1中的方法对美人鱼发光杆菌OmpV蛋白进行PCR扩增后,分别连接到PETHIS及PLLP-OmpA中并最终分别转入E.coli BL21和Top10中。图3是对E.coli BL21OmpV转化子经IPTG诱导表达后的SDS-PAGE图谱。从图3中可以清楚地看到OmpV蛋白的表达。对此经诱导表达的菌株以及同样经过诱导的E.coli Top10+PLLP-OmpA-OmpV进行了盐耐受能力的分析,表3为在各盐度平板接种24小时后的生长观察结果。

  注:+表示有菌落;-表示不生长从表3中可以看出,E.coli Top10+PLLP-OmpA-Omp比对照株E.coli Top10+PLLP-OmpA盐的耐受力上降低了一个盐度,这明显表明了美人鱼发光杆菌OmpV与盐敏感的直接相关性。

  同时,可以看到E.coli BL21+PET-OmpV与其对照株E.coli BL21+PET在盐耐受度上基本相同,没有表现出OmpV导入后对其耐盐能力的下降。其原因主要是,OmpV在E.coliBL21+PET-OmpV中表达后仍然存在于胞内,很难到达外膜部位,从而无法发挥其在盐敏感性的作用。而在使用PLLP-OmpA载体后,由于载体上所带的OmpA信号肽的作用,使诱导表达的OmpV蛋白可以分泌到胞外,在通过某种方式插入外膜后OmpV蛋白就表现出其在盐敏感性上的作用。使用这两种载体得出的不同结果进一步表明了,OmpV表达导致盐敏感性的提升是OmpV蛋白自身的作用,而不是其诱导表达后导致细胞其它变化而产生。

  实施例4  美人鱼发光杆菌OmpV多肽的制备和提纯将全长的美人鱼发光杆菌OmpV编码序列或片段构建入大肠杆菌蛋白质原核表达载体之中,以达到表达和提纯目的蛋白。

  大肠杆菌DH5α克隆载体的构建,以及转化DH5α感受态细胞:根据以上设计好的引物,分别对应于编码序列5′和3′端的约20个核苷酸,并在正反引物上分别引入限制性内酶位点(这根据选用的大肠杆菌表达质粒PET-HIS而定),以便构建克隆和表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板,经PCR扩增后,将美人鱼发光杆菌OmpV基因克隆至E.coli表达质粒PET-HIS.用合适的内切酶将质粒线性化。用琼脂糖胶电泳来确定质粒的纯度和浓度。将线性化的克隆质粒,用化学热激法转化到克隆载体E.coli DH5α感受态中。全部涂于LB+Amp平板上,37℃培养12~16小时。

  克隆进美人鱼发光杆菌OmpV蛋白的DH5α阳性克隆的筛选、鉴定:随机挑取LB+Amp平板上的大肠杆菌菌落,接种于LB+Amp液体培养基上,同时接种含有空PET-HIS质粒的DH5α,过夜培养,用碱裂解法分别提取质粒,并对所提取出的质粒分别进行PCR验证,得到PCR验证图谱如图4所示。

  大肠杆菌BL21表达载体的构建,以及转化BL21感受态细胞:将以上检测出含有美人鱼发光杆菌OmpV蛋白基因的质粒用同样的化学热激法转化进BL21感受态。全部涂于LB+Amp平板上,37℃培养10-16小时。

  表达美人鱼发光杆菌OMPV蛋白的BL21阳性克隆的筛选、鉴定:随机挑取LB+Amp平板上的大肠杆菌BL21菌落,接种于LB+Amp液体培养基上,同时接种未转化的BL21和含有PET-HIS空质粒的BL21,于30℃中度轻摇至OD值为0.6,加入IPTG100ug/ml 35℃诱导两个小时,离心收集菌体,SDS-PAGE检测表达产物,结果如图2所示。

  利用Western blot检测OmpV蛋白在转基因E.coli中的表达:1、蛋白的获取:按上述方法表达美人鱼发光杆菌OmpV蛋白。

  a)加样前,将样品置于LSB加样缓冲液(2*加样缓冲液:甘油2.4g,1M Tris-HCl pH6.8 1ml;溴酚兰0.01%,H2O定容至20ml),煮沸3~5分钟;b)4℃80V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳,直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。

  3、蛋白质向硝酸纤维膜上转移:a)转移之前,用转移缓冲液(39mmol甘氨酸,48mmolTris Base,0.037%SDS,20%甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟;b)4℃下用DYY-7B电转仪50V转移2小时,凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。

  4、膜上蛋白的检测:a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中,室温缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液:取5g脱脂奶粉溶于100ml TNT;b)再将膜浸泡在洗涤缓冲液中,室温洗涤三次,每次10分钟;c)加入第一抗体(抗美人鱼发光杆菌OmpV的抗体),室温反应60分钟;同步骤b),洗涤三次;d)加入第二抗体(辣根过氧化酶兔抗鼠二抗),室温反应60分钟;同步骤b),洗涤三次;e)加入底物DAB显色观察蛋白条带。

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